《中成药》杂志

CN 31-1368/R

ISSN 1001-1528

ZHONGCHENGYAO
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HPLC同时测定中药紫菀中5种黄酮类成分的含量

王甫成1，夏成凯1，栗进才1，龚道峰1，唐超2

（1.亳州职业技术学院,安徽 亳州 236800  2.山东中医药大学,山东 济南 205355）

 [摘要]  目的：建立同时测定紫菀药材中槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素的方法。方法：采用HPLC法，kromasil 100-5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长284，350 nm。结果：槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素分别在0.032 2～0.322 0 μg、0.085 6～0.856 0 μg、0.032 6～0.326 0 μg、0.054 6～0.546 0μg、0.0614 0～0.614 0 μg范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为99.36%（RSD 1.65%）、100.11%（RSD 1.01%）、98.71%（RSD 2.25%）、101.10%（RSD 1.40%）、98.60%（RSD 2.27%）。结论：该方法简便快速，准确可靠，重复性好，可为全面控制紫菀药材的质量提供参考。

[关键词]  紫菀；槲皮素；木犀草素；橙皮苷；山奈酚；芹菜素；HPLC

Simultaneous determination of five constituents in Asteris Radix et Rhizoma by HPLC

WANG Fu-cheng, XIA Cheng-kai，LI Jin-cai，GONG Dao-feng1，TANG Chao2

（1. BoZhou Vocational and Technical College, Bozhou, 236800, China; 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 205355, China）

KEY WORDS: Asteris Radix et Rhizoma; quercetin; luteolin; hesperidin; kaempferol; apiolin; HPLC

紫菀为菊科植物紫菀Aster tataricus L. f．的根及根茎。别名青菀、 还魂草等 ,生于低山阴坡湿地、 山顶和低山草地及沼泽地 ,海拔 400～2000 m[1]。有润肺下气、消痰止咳之功效，用于痰多咳喘，新久咳嗽，劳嗽咳血等病症[2]，在临床上常用于治疗支气管炎、咳喘、肺结核等。《本草纲目》中记载,紫菀“主治咳逆上气, 胸中寒热结气,去蛊毒痿蹶”是许多常用的止咳平喘复方中药制剂中的重要组成药物之一。现代药理学研究表明其有效部位为乙酸乙酯部位[3]，药学研究证实其乙酸乙酯部位含丰富的黄酮类物质，分离出来的单体成分有槲皮素、橙皮苷、木犀草素、山奈酚、芹菜素等[4、5]，而槲皮素成分有祛痰止咳平喘的功效，橙皮苷、山奈酚也常用于支气管炎的治疗等，与紫菀止咳平喘功效密切相关，并且越来越多的研究表明植物体内的黄酮类物质具有明显的抗氧化、抗炎、抗病毒等优势[6]，本研究采用HPLC法对紫菀药材中的5种黄酮类指标成分进行含量测定，为全面控制紫菀药材的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器  仪器Agilent 1200高效液相色谱仪；Agilent 1200 G1316A TCC DE63067867检测器；AF240型电子天平（感量0.000 01 g，中国瑞士梅勒公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz，江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药  槲皮素对照品（100081-200907）、木犀草素对照品（111520-200201）、橙皮苷对照品（0721-200010）、山奈酚对照品（110861-200303）、芹菜素对照品（111901-201001），均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

实验所用紫菀药材来源于不同产地，于安徽亳州中药材交易中心收集，由安徽科技学院时维静教授鉴定为菊科植物紫菀Aster tataricus L. f．的根及根茎。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的配制  分别取槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成各对照品储备液，取各对照品储备液适量，加甲醇稀释制成每1 mL含槲皮素0.032 2 mg、木犀草素0.085 6 mg、橙皮苷0.032 6 mg、山奈酚0.054 6mg、芹菜素0.061 4 mg的混合对照品溶液，即得 

2.2 供试品溶液的配制  取样品粉末（过四号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件  色谱柱：kromasil 100-5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱,0～15 min，20%～20% A，检测波长：284 nm；15～30 min，20%～35% A，检测波长：350 nm；30～35 min，35%～20% A,检测波长：350 nm。流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。进样10 μL。色谱图见图1。                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.橙皮苷2.槲皮素3.山奈酚4.木犀草素5.芹菜素

图1 供试品(A)、混合对照品(B) HPLC图

1.hesperidin 2.quercetin 3.kaempferol 4.luteolin 5.apigenin

Fig.1 HPLC chromatograms of samples (A) and mixture reference substance (B)

2.4 线性关系考察 取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10ml于10ml量瓶中，用甲醇依次稀释至刻度，制得各对照品系列浓度，按照2.3项下色谱条件进行测定。以槲皮素、木犀草素、橙皮苷、芹菜素进样量（μg）为横坐标（X），对应峰面积为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y=103 245.3X+312.7 (r=0.999 2)、Y = 97 321.4X -294.3 (r=0.999 7)、Y = 51 437.1X +46.2(r=0.999 8)、Y = 67 157.1X -69.1(r=0.999 9)、Y=193 178.2X-47.7( r=0.999 6)。结果表明，槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素进样量分别在0.032 2～0.322 0 μg、0.0856～0.856 0 μg、0.032 6～0.326 0 μg、0.054 6～0.546 0μg、0.0614 0～0.614 0 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验  精密吸取2.1项下混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件采用标准对照法进行测定，重复测定6次，进样量10 μL。结果槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素的RSD分别为2.01%（n=6）、0.79%（n=6）、1.31%（n=6）、2.01%（n=6）、1.45%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验  取上述供试品溶液分别于配制后的0、3、6、12、24 h测定槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素的峰面积，进样量10 μL。结果相应5种成分峰面积的RSD分别为0.93%（n=6）、1.83%（n=6）、2.01%（n=6）、1.35%(n=6)、1.78%（n=6），表明供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验  取同一批亳州沪谯中药饮片厂购买的紫菀药材样品，共6份，分别按2.2项下方法制得供试品溶液，按2.3项下色谱条件采用外标一点法进行测定，进样量10 μL。结果样品中槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山奈酚、芹菜素平均含量分别为0.29 mg·g-1、1.41 mg·g-1、0.15 mg·g-1、0.52 mg·g-1、1.72 mg·g-1 ，RSD分别为2.01%（n=6）、1.49%（n=6）、2.12%（n=6）、1.97%（n=6）、1.91%（n=6），表明本含量测定方法重复性较好。

2.8 加样回收试验  取已知含量的沪谯中药饮片厂的紫菀药材样品，共6份，各约1g，精密称定，分别精密加入槲皮素对照品溶液（0.032 2 mg/ml）10ml，木犀草素对照品溶液(0.085 6 mg/ml)15ml,橙皮苷对照品溶液(0.032 6 mg/ml)5ml,山奈酚对照品溶液（0.0546mg/ml）10ml，芹菜素对照品溶液 (0.0916mg/ml)对照品溶液20ml，加入甲醇补足至100ml，按2.2项下方法操作，制得供试品溶液，按2.3项下色谱条件采用标准对照法进行测定，进样量10 μL，计算加样回收率，结果见表1。

表1  紫菀中5种黄酮类成分加样回收试验结果（n=6）

Tab.1 Results of recovery test of five constituents in Radix Asteris( n=6)

成  分

样品含量

加入量

测得量

回收率

平均回收率

RSD

/mg

/mg

/mg

/%

/%

/%

槲皮素

0.2936

0.322

0.6089

97.92

99.36

1.65

0.2984

0.322

0.6215

100.34

0.2971

0.322

0.6152

98.79

0.3063

0.322

0.6317

101.06

0.3003

0.322

0.6132

97.17

0.2963

0.322

0.6212

100.90

木犀草素

1.3715

1.284

2.6458

99.24

100.11

1.01

1.4415

1.284

2.7316

100.48

1.3863

1.284

2.6812

100.85

1.4247

1.284

2.7289

101.57

1.3896

1.284

2.6613

99.04

1.4142

1.284

2.6915

99.48

橙皮苷

0.1567

0.163

0.3209

100.47

98.71

2.25

0.1452

0.163

0.3012

95.71

0.1506

0.163

0.3125

99.33

0.1552

0.163

0.3209

101.66

0.1513

0.163

0.3093

96.93

0.1468

0.163

0.3068

98.16

山奈酚

0.5214

0.546

1.0693

100.35

101.10

1.40

0.5019

0.546

1.0443

99.34

0.4987

0.546

1.0527

101.47

0.5011

0.546

1.0586

102.11

0.5210

0.546

1.0843

103.17

0.5198

0.546

1.0667

100.16

芹菜素

1.704

1.832

3.516

98.87 

98.60

2.27

1.879

1.832

3.684

96.58 

1.734

1.832

3.571

100.14 

1.687

1.832

3.454

95.31 

1.712

1.832

3.526

99.49 

1.798

1.832

3.674

101.21 

2.9 样品含量测定  取不同产地的紫菀药材样品，按2.2项下供试品溶液制备法制得供试品溶液，并按2.3项下色谱条件采用标准对照法进行测定，结果见表2。

                      表2 不同产地紫菀中5种黄酮类含量测定结果（n=3）mg.g-1

Tab.2　Contents of five constituents in Radix Asteris from different habitats（n=3）mg.g-1

来源

槲皮素

木犀草素

橙皮苷

山奈酚

芹菜素

安徽亳州

0.18

0.61

0.25

0.55

0.83

河北安国

0.22

1.68

0.24

0.65

1.87

山东曲阜

0.27

1.71

0.18

0.63

1.89

山东菏泽

0.17

0.82

0.26

0.53

0.78

吉林通化

0.18

0.54

0.32

0.74

1.03

安徽芜湖

0.32

1.51

0.17

0.35

0.62

河南商丘

0.21

0.61

0.21

0.66

1.02

江苏沛县

0.23

1.12

0.24

0.59

0.84

3 讨论

3.1 检测波长的确定  通过对各成分紫外吸收曲线的分析槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素均在350 nm左右有较高吸收，为方便检验，选择这4种成分的检测波长为350 nm，并且参考相关文献[7、8、9]，槲皮素、木犀草素、芹菜素等成分均可在350 nm处检测，而且本研究证实这4种成分均可在350 nm处测定，峰面积响应及线性良好，且杂质干扰较少。橙皮苷在284 nm处检测灵敏度较高，故选择检测波长为284 nm。

3.2 流动相的优选  对流动相进行了优选，包括甲醇-醋酸溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等流动相系统，最终选用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，各成分峰型和分离度均较好。

3.3 本研究对紫菀中的5中黄酮类成分进行含量分析，适应现代中药多成分、多靶点、综合治疗作用的要求和特点，为紫菀药材的质量控制提供一定参考。本研究所测定的不同产地紫菀药材中的5种成分，有些成分含量有所差异，可能与药材的采收时间、生长环境等因素有关。

[参考文献]

[1] 侯海燕 ,陈立 ,董俊兴. 紫菀化学成分及药理活性研究进展[J].中药学杂志，2006,41（3）:161

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010,322

[3] 卢艳花，戴岳，王峥涛，等.紫菀祛痰镇咳作用及有效部位和有效成分[J].中草药,1999,30（5）：360

[4] 王国艳，吴弢，林平川，等.紫菀酚类化学成分的研究[J].中国中药杂志,2003,28 (10): 946

[5] 刘可越，张铁军，高文远，等.紫菀中多酚类化合物的研究[J].中草药,2007,38(12)：1793

[6] NG T B ,LIU F ,LU Y H , et al . Antioxidant activity of compounds from the medicinal herb Aster tataricus [J]. Comp Biochem PhysiolPartC ,2003,136(2):109-115

[7] 审海进，郭巧生，房海灵，等. RP-HPLC测定野菊花中槲皮素、木犀草素、芹菜素和刺槐素[J].中国中药杂志,2010,35(2):191

[8] 范丽芳，王巧，张兰桐，等. 河北地道药材紫菀的指纹图谱研究[J].中草药,2007,38(10):1566

[9] 周军辉，伍蔚萍，谢子民，等.紫菀药材的高效液相指纹图谱与定量分析[J].中药材,2004,27(8):562

编辑老师问题：1.图题、表题请补充英文。

四修说明：1. 图题、表题请补充英文以补充完全，请编辑老师审核。

          2.另作者简介补充完整，修改了一个错别字，修改和补充的地方都用红色字体标识。

          3.最后非常感谢编辑老师的审校与悉心指导。

编辑老师问题：1.文中写明单标与混标分别是多少？ 2.参考文献不少于12篇。

三修说明：1.对照品浓配稀释问题已在文中注明，并在二修中说明，应该符合此类文章的要求；2.本研究对紫菀黄酮类成分进行定量分析，国内相关研究较少，经查阅相关文献库，补充了2篇相关参考文献。（确实很难找到可以参考的文献了。）3.十分感谢编辑老师意见，顺祝：工作顺利，身体健康！

编辑老师问题：制备的是混合对照品溶液，但线性中说各取对照品溶液？加样回收也有相同问题

二修说明：感谢编辑老师再次提出修改意见！

原文中确实有交代不清楚的地方。通过查阅实验记录，下面就对照品的配制问题进行说明：

槲皮素对照品：16.10mg→10ml(母液)  

木犀草素对照品：21.40mg→10ml(母液)

橙皮苷对照品：16.30mg→10ml(母液)    

山奈酚对照品：13.65mg→5ml(母液)

芹菜素对照品：15.35mg→5ml(母液)

精密量取槲皮素对照品母液、橙皮苷对照品母液、山奈酚对照品母液、芹菜素对照品母液各1ml和木犀草素对照品母液2ml，至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（槲皮素0.032 2 mg/ml、木犀草素0.085 6 mg/ml、橙皮苷0.032 6 mg/ml、山奈酚0.054 6mg/ml、芹菜素0.061 4 mg/ml）。

在做加样回收试验的时候，由于各成分含量存在差异性，所以采取分别加入对照品溶液的方法进行试验，为节约对照品，取各对照品溶液母液，取适宜体积进行稀释，然后加入适宜体积的对照品稀释液进行试验。其中，芹菜素对照品由于试验中出现问题，重新配置了新的对照品进行试验。 

可能是个人试验习惯问题，本课题组采用对照品单独浓配（方便其他课题使用，而不是5种成分直接混合），后进行稀释操作应用。

一修说明：首先十分感谢编辑和审稿老师在百忙之中对本研究论文的审阅修改，现将修改说明阐述如下：

1、线性关系考察中对照品溶液的具体稀释步骤现已经在原文表明。

2、重复性试验采用的是购自沪谯中药饮片厂的紫菀药材，现已在文中注明。本文采用标准对照法（外标一点法）进行含量测定，现已在文中注明。

3、①加样回收取样为1g，原文中为笔误。②加样回收我们加入的是不同浓度的对照品溶液，现将对照品溶液的浓度及加入量现已在原文中注明，为节约对照品，大部分对照品采用的是线性关系考察所配的对照品溶液，故加入的对照品经计算后看上去非常精确。